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电镜技术教学课件

2019-11-06来源:玟丽听我讲故事

一、电子显微镜的发展历程

1924年,法国Broglie提出了“电磁波与光一样,具有波 动性“的假说,并计算出电磁波长为0.005nm。1926年,德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或磁场中偏转聚焦的现象。1928—1931年间,德国的Ruska成功研制了世界上第一台真正的电子显微镜,放大倍数为1200倍。20世纪50年代初到60年代末期,电镜分辨本领得到大幅度提高,达到1nm左右,到80年代的点分辨率已接近0.1nm,最新研制的超高压透射电镜(1000KV)的点分辨率可高达0.001nm。

21世纪:球差校正电镜及冷冻电镜技术等高端电镜将被开发应用于广泛的领域。       

二、电镜的基本类型

包括透射式电子显微镜和扫描式电子显微镜两大类。

根据电子枪发射方式不同可分为热阴极和场发射两种。

其他分类:冷冻或低温电子显微镜、高压或超高压电子显微镜、分析电镜、扫描隧道显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描光子显微镜、原子力显微镜、环境扫描电子显微镜、聚焦离子束显微镜等约几十种不同类型电镜。

  如下为透射电镜

如下为扫描电镜

透射电镜和扫描电镜原理图解:

三、生物电镜的研究对象

电子显微镜被认为是研究微观世界的“科学之眼”,电子显微学也由此诞生。电镜从最初的细胞研究入手,从组织学到细胞学再到超微病理学,而到如今的结构生物学及蛋白分子三维结构研究。

在材料方面从形貌研究到晶体研究到元素分布再到原子结构分析。

生物电镜研究对象:

1、生物体形态研究:昆虫体表表面结构(如眼睛、翅膀及体表微结构)及细菌病毒等微生物结构研究、等等。

2、细胞器结构及元素分析研究:线粒体、内质网、核糖体和分泌颗粒等;各种细胞内部的元素分布情况分析等。

3、生物膜结构研究:细胞膜性结构(如线粒体膜、核膜、内质网膜以及神经髓鞘等)。

4、蛋白基因结构研究:各种基因及通道蛋白定位及定性研究;酶细胞化学研究;抗原抗体研究(胶体金技术);等等。

5、细胞器及蛋白分子三维结构研究:各种细胞器及蛋白的三维结构研究,包括连续切片技术、冷冻技术和三维重构技术等。

示例图(来自网络转载)

1激光共聚焦显微镜

2、环境扫描电镜图

3、冷冻扫描电镜图

4、蛋白分子三位重构图

四、电磁透镜

        由于轴对称弯曲磁场对电子束有聚焦作用,因而可以得到电子光学像。我们称这种具有轴对称弯曲磁场装置构成的电子透镜为电磁透镜(electron magnetic lenses)。由于电磁透镜磁场非均匀分布,物、像点在磁场之外,电子在磁场中既受到轴向分量的作用,又受到径向分量的作用,使平行于轴进入磁场的电子束可获得聚焦。

五、电镜的几种图象异常现象

1、球差:电子束光源通过透镜受到偏转,通过样品,从物平面向下发射,形成物点孔径角。从物点发出的射线,到达下一级透镜又被聚集。如果透镜有缺陷或孔径角太大,则靠近光轴的射线和远离光轴的射线,受到电磁场的作用就会不同,这些射线在光轴上会聚的位置不同,结果远离光轴的射线就会在像面上形成一个最小模糊圈。此时可有图象中央凸起感。这是目前影响电镜分辨率的一个主要因素。(目前有球差校正电镜) 

2、像散:由于透镜的磁场强度在纵向或横向上不同,以致纵向与横向上的射线聚焦于光轴的位置也有上有下,两者共同形成一个最小模糊像。

3、色差:由于电磁波长随加速电压而变化,当加速电压不稳定时,电子束波长就可变异,因而发生类似的像差。

4、畸变:由于离轴较远处的径向磁场的作用力强,使放大倍数随物点离轴的距离而变化,进而使图象发生改变而产生的。畸变常见的有枕形畸变、桶形畸变和S形畸变等。

5、反差欠佳:人的眼睛在区分物体时,主要根据物体不同部位或物体之间的光强度与波长的差别,这些差别构成了物体的反衬度,又称为“反差”。电镜与光镜一样也存在反差现象。由于电镜标本上的不同部位的物质结构不同,疏密度不同,它们散射电子的能力也各不相同,散射电子能力强的地方,显现为暗像;相反,散射能力弱的地方,显现为亮像。因此,在荧光屏上所看到的是由暗像与亮像组成的具有一定反差的荧光图像。

以上五种现象可以通过技术调整可以改善的。


六、标本制作技术

1、超薄切片: 电子束的穿透能力一般较弱,大多数标本无法直接在电镜下观察,必须把样品切成厚度为 10—1000nm 的薄片。我们把切片厚度小于100nm的薄片称为超薄切片,是电镜观察生物样品常用方法之一,常用厚度为50-100nm。

透射电镜标本制作流程如下:

取材——漂洗(生理盐水)——前固定(2.5%戊二醛,4ºC冰箱2小时以上)——漂洗(0.1M 磷酸缓冲液,3次,45分钟)——后固定(1%锇酸1小时左右)——漂洗(0.1M 磷酸缓冲液,3次,45分钟)——块染(1%醋酸铀2小时)——梯度脱水(50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分钟, 100% 2次,各10分钟)——浸透(丙酮:包埋液=1:1,37 ºC烘箱2小时;丙酮:包埋液=1:4, 37ºC烘箱过夜;纯包埋液45ºC烘箱2小时)——包埋聚合(45ºC烘箱3小时,65ºC烘箱48小时)

扫描电镜标本制作流程如下:

取材(做好样品观察面的标志)——漂洗(生理盐水或缓冲液)——固定(2.5%戊二醛2小时以上)——漂洗(0.1M磷酸缓冲液,3次,45分钟)——后固定(1%锇酸,2小时)——脱水( 50%、70%、80%、90%、95%各15分钟,换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟)——干燥(零界点干燥或冷冻干燥)——镀膜(真空镀膜仪或离子溅射仪)

2、取材要求:

快:取材时间在组织离体后1—2分钟以内将组织块浸入固定液内,时间越短越好。

小:组织块大小在1立方毫米左右或横切面为1平方毫米的长条形,有些比较致

密的组织如骨组织、皮肤及结缔组织等应小于1毫米。

冷:固定液温度在4摄氏度左右。

准:取材部位要准确,尽量取材于所要观察的部位且各实验组均要保持一致。

3、取材方法:

1、器官组织取材法:主要针对活体组织的取材如肾、肝、肺、胃肠道等组织。

2、游离细胞收集法:主要针对培养细胞及游离细胞如血细胞、脱落细胞等。常用方法有血浆或血清预包埋法。

4、标本取材方向及大小示意图

双刀切割法示意图(转载)


七、常见器官组织取材法

睾丸组织取材法:

1、灌注固定:主动脉灌注。

2、注射固定:先在睾丸上扎几个孔,然后将固定液注射进去,此法应用于睾丸间质结构研究。

3、浸泡固定:将睾丸内精细小管切碎浸入固定液内进行固定。

4、位置选择:观察生精细胞或支持细胞,取材于睾丸的睾丸网部位,大鼠与小鼠的睾丸网比较表浅,就在白膜下附近。如果要观察成熟精子,最好取材于附睾的尾部,此处精子已基本成熟,而且精子密度最高。


肝组织取材法:

1、灌注固定法:主动脉灌注

2、浸泡固定法:动物经麻醉后打开腹腔,暴露出肝脏,先用细线扎紧肝脏根部防止出血,接着用手术剪剪下,选取一片肝小叶组织放在滴有固定液的蜡板上进行修块,切成1立方毫米大小即可。


脑组织取材法:

1、脑组织灌注固定:主动脉灌注(4%多聚甲醛溶液)

2、取材位置选择:如研究脑神经轴索、髓鞘以及神经胶质细胞,建议取材于脑组织白质部分,此处有髓神经纤维相对较多,胶质细胞比较丰富;如要研究神经元以及血脑屏障结构,建议取材于脑皮质的灰质部分。

3、定向包埋,以神经元长轴方向(大约为脑组织的矢状面)作为切面方向,这样可以很好地观察神经元细胞核、轴突以及树突结构,突触以及毛细血管的结构也比较容易见到。


肺组织取材法:

1、灌注固定:从肺循环途径灌注。

2 、支气管肺泡灌洗法:从主支气管口将固定液注射进去,让固定液充满整个肺组织,动作要轻柔。

3、负压法固定:取小块肺组织放入装有固定液的青霉素小瓶内塞紧橡胶塞子,将注射针刺穿塞子,通过抽吸瓶内空气达到固定液浸入组织内部的目的。

4、载玻片挤压法:将组织小块放在载玻片上,并将固定液滴在其上,再用另外一片载玻片压在上面并轻轻一松一压,反复几次直到没有气体排出为止。

5、位置选择:如果以研究支气管粘膜或研究肺动脉为主的(这里指肺内的支气管),尽量取材于靠近肺门部位。如果研究肺泡上皮细胞、终末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔的结构等,建议取材于肺尖部或靠近胸膜一侧的边缘部分。  


肾组织取材法:

1、灌注固定法:主动脉灌注

 2、浸泡固定法:将实验动物麻醉后打开腹腔暴露出肾脏组织,用细线结扎肾门防止出血,然后取下肾脏,放在事先准备好的蜡板上进行取材。

2、位置选择:根据需要切取皮质或髓质进行观察。动物肾组织取材要注意的是,一要取材位置选择在肾的上极,二要准确判定皮质与髓质的位置,如果是皮质部位,只要将包膜分离后,将肾最外层组织取下来即可,这里一般都会有肾小球存在。一般要求切长条形。


胃肠道取材法:

1、胃 :剖开胃腔,暴露出粘膜面,用PBS或生理盐水浸洗内腔,尽量清洗干净,但注意保护好粘膜面以免损伤,然后用双刀切割法切出长条形,必须带有粘膜层。

2、肠:用剪刀剪下约1cm长小段,在生理盐水中清洗干净,如果肠腔较小,可切成环状,厚度不超过1mm;或肠腔较大可剖开摊平切成长条形(必须带有粘膜层)。

注意:各实验组选取部位尽量在相同部位,以利实验比较。


骨组织取材法:

取小块骨片(1~2mm大小),先用2.5%戊二醛固定2小时,磷酸缓冲液漂洗2次,再将骨片浸入脱钙液进行脱钙处理,视脱钙效果而定脱钙时间,如用EDTA脱钙液,大约3天时间,主要视组织块是否变得柔软,通常用细针刺脱钙骨片是否容易刺穿来判断脱钙效果。

软骨组织一般直接固定,不需要脱钙处理。


皮肤组织取材法:

皮肤组织一般观察表皮细胞及部分固有层结构,取材以长条形为主,长约1.5mm,横径在0.5mm-1.0mm,包括表皮全层细胞及部分固有层(依据上文定向取材图示处理),表皮是复层鳞状上皮层,无血管分布。真皮部分位于表皮深面,主要由胶原纤维和弹性纤维交织构成,并含有从表皮陷入的毛发和腺体,以及从深层来的血管、淋巴管、神经及其末梢,一般不需要定向取材,但要注意位置的准确。


外周神经取材法:

脊椎动物的外周神经系统包括由脑发出的脑神经和由脊髓按节段性排列发出的脊神经。按所联系的器官不同,可分为躯体和内脏两大类,每一类又可按照传导兴奋的方向不同而分为传入神经和传出神经两类。取神经纤维时,应先分离掉包裹神经的神经外衣,再分离出所要研究的神经。如果神经纤维直径小于1mm,可直接切成1mm小段即可,如果直径较大,可切成圆片状,厚度小于1mm,或一分为二。需要注意的是,在包埋的时候必须纵横方向定向包埋。

横切面

纵切面


骨骼肌取材法

每块肌肉都是具有一定形态、结构和功能的器官,有丰富的血管、淋巴管分布,在神经支配下收缩或舒张,进行随意运动。肌肉具有一定的弹性,当外界刺激较激烈的情况下,肌肉往往出现痉挛现象,因此,切取肌肉组织后应先浸泡在生理盐水或磷酸缓冲液中,待肌肉恢复自然常态后再进行切割,纵横方向都要取,以细长条形为主,长度不超过2mm,然后浸入固定液内进行固定。


胰腺组织取材法:

浸泡固定:将取下的胰腺放入蜡板上固定液内,根据要求取材相应部位,大小约1mm。胰腺可分为胰头、胰体和胰尾三部分。

胰腺一般观察胰岛细胞、腺泡细胞以及导管细胞。

胰岛主要分布在胰尾部位,靠近中央胰管,胰体部位较少。

腺泡及导管基本存在于胰体内,容易取材。

值得注意的是,由于胰腺腺泡内酶原颗粒非常丰富,容易引起细胞自溶,取材时要尽量快速取材以免细胞自溶影响结果。


肿瘤组织取材法:

肿瘤的生长位置几乎遍布全身,肿瘤组织主要观察肿瘤细胞的组织来源、细胞类型、分化程度以及与周围组织的关系等内容。

电镜标本的取材应多位置取材,包括肿瘤的实体内部、生长发生部位、与周围正常组织的交界部位以及癌旁组织。各部位均要取若干个组织块进行固定,这样才能观察的比较全面,尤其怀疑是恶性肿瘤的组织。大小约1mm以内。


游离细胞取材法:

1、贴壁细胞:如果在培养瓶内,可将培养液清洗干净后用胰酶消化法进行消化脱落处理,或者在培养瓶内倒入固定液浸没细胞约30分钟后,用细胞刷将细胞刷下离心成团,再将细胞团取下加入血清内(血清刚好满过细胞团即可,最后沿着管壁将固定液加入继续固定,放置于4℃冰箱内保存。如果在载玻片爬片生长,可以将玻片整个浸入固定液内,然后用刀片沿着边缘切割出方块区域,用尖镊子剥离细胞层;或打碎玻片将细胞层剥离即可。

2、悬浮细胞:将细胞离心沉淀后去掉培养液,将细胞团取出,必要时可采取变速离心分层游离细胞。而后加入固定液固定30分钟后去掉固定液,再加入血清(下同贴壁细胞)。

3、细菌、病毒、脱落细胞等:将它们制成悬液放置于尖底离心管内(最好是玻璃的),离心成团(1000~3000转/分钟,10分钟,下同),去上清液后加入2.5%戊二醛固定30分钟左右,离心,再弃去多余的固定液,然后加入血清混合,(下同1、2操作)。


八、微波快速制样法(适用于临床标本诊断):

取材(按常规要求方法)——3%戊二醛固定后经微波高火照射20秒,室温继续固定20分钟——1%磷酸缓冲液漂洗4次,每次5分钟,微波中火照射20秒——1%锇酸微波中火照射10秒,室温继续固定20分钟——丙酮50%、70%、80%、90%脱水,微波中火照射20秒,室温继续脱水2分钟。100%丙酮脱水3次,每次微波中火照射20秒,室温3分钟——丙酮:包埋剂=1:1浸透,微波中火照射20秒,室温继续浸透5分钟——丙酮:包埋剂=1:3浸透,微波中火照射20秒,室温继续浸透5分钟,2次——纯包埋剂微波中火照射20秒,室温10分钟——常规包埋——聚合:70℃ 20分钟,95℃ 30分钟,110℃ 60分钟——半薄切片光镜定位——超薄切片——醋酸铀微波中火照射染色30秒,双蒸馏水漂洗——枸橼酸铅微波中火照射染色20秒,双蒸馏水漂洗——45℃烘箱干燥——电镜观察。

注意:高火:600——800W ;中火:约400W。


九、负染技术:

     观察颗粒状生物材料的外部形状常用的染色方法。

     利用重金属盐沉积到样品四周,样品四周散射电子的能力就较强,因而表现为暗区;样品本身散射电子的能力较弱,则表现为亮区,这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。常用磷钨酸盐或醋酸铀溶液。


 10、酶细胞化学的常规操作流程

1、固定:常规固定液选取2.5%戊二醛和4%多聚甲醛混合液作为固定液,常用的缓冲液有二甲砷酸钠缓冲液及Tris缓冲液等。

2、切片:一般采用组织切片机进行切片,厚度在40~60µm,也可以用冰冻切片机切片。

3、漂洗:用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次,每次10分钟。

4、孵育:孵育时必须在使用前配置新鲜孵育液。将切片放入孵育液内,在震荡式恒温水浴箱中孵育,孵育温度一般为37℃。

5、漂洗:用配置孵育液的缓冲液进行漂洗3次,每次10分钟,然后用0.1M二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次,每次10分钟,所用缓冲液要保持在4℃左右。

6、后固定:用0.1M二甲砷酸钠缓冲液配置的1%锇酸固定1小时。脱水、浸透、包埋、切片同常规超薄切片制作。

7、电镜观察:超薄切片经烘干后直接进行电镜观察。如果反差不好,可以进行铅—铀双重染色,但必须有不染色的切片对照。


11、标本回顾性研究——石蜡块做超薄切片技术

1、定位取材:根据光镜显示,切取需要的部位,大小约1mm3的若干小块。

2、溶蜡:先在37℃烘箱内熔蜡4小时,再二甲苯37℃烘箱内浸泡8—12h,期间要震荡摇换几次。

3、水化:用100%(1小时)、90%、80%、70%丙酮进行水化(各15分钟) ,直到完全水化。

4、漂洗:用0.1M磷酸缓冲液漂洗两次,各15分钟。

5、固定:用2.5%戊二醛固定2小时以上,其余步骤同常规电镜样品制作处理。


12、电镜三维重构技术:

       三维重构技术是电子显微术、电子衍射与计算机图像处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术,尤其适于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构。其基本步骤是对生物样品在电镜中的不同倾角下进行拍照,得到一系列电镜图片后再经傅里叶变换等处理,从而展现出生物大分子及其复合物三维结构的电子密度图。

        可以对均一的(如膜蛋白的二维晶体,二十面体对称的病毒等对称结构)不均一的(如核糖体等)样品用不同的方法进行三维结构重构,可以对生物大分子及其复合物或亚细胞结构进行测定,使小到蛋白质大到真核细胞的三维结构得以确定,分子量大小跨越了12个数量级。通过快速冷冻可以将样品保存在生活状态,其结构更接近功能活性状态;由于快速冷冻可以捕捉到反应过程的瞬时状态从而易于进行时间分辨层面上的研究,从而对一些反应瞬时过程,和反应中间体进行研究,有助于对蛋白质的动力学特性和功能的研究。

示例(来自网络转载):


13、电镜应用简介:

1、生命科学上的应用:几乎包括所有的学科研究领域都已经用到或即将用到电镜技术。比如动物或植物细胞的超微结构(包括细胞核、细胞质及其细胞器等内容物、细胞间的连接等)的形态观察,通过对比观察,对动植物形态在超微结构水平上进行分类、分型,以探讨遗传、变异及病理病因的机理或机制,为生命科学的基础研究所不可或缺的研究手段。

       利用常规电镜技术和特殊电镜技术如免疫技术、酶细胞化学技术、原位杂交技术、冷冻技术及三维重构等进行细胞超微结构及超微病理分析,以及细胞内抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究,生物大分子三位结构等。

2、在临床诊断中的应用:主要应用于临床活检组织的超薄切片观察分析。通过活检组织的细胞形态变化及其相互间的关系,根据其形态变化规律和特点进行分析诊断,为临床病理诊断或辅助诊断提供较可靠的形态依据。

      在鉴别肿瘤组织来源、分化程度、浸润情况等,以及疾病的病理分型或分期和疾病的早期病理改变等方面,电镜比光镜具有一定的优势。病原微生物(如细菌、病毒、支原体、囊虫等)的形态观察或鉴别也是电镜观察的强项。

3、材料上的应用:包括材料的内、外部结构或形貌观察,颗粒形态、大小测量、排列分布等情况。如果应用能谱分析仪器,就可以检测材料的元素组成、含量、分布等情况。

4、其他领域上的研究:如矿物质、考古、鉴别等。


14、透射电镜技术要诀

切片质量好不好,快小冷准要记牢;

要想固定效果好,标本体积必须小;

锇酸固定是关键,充分漂洗做在前;

块染之前需水洗,梯度脱水从低起;

聚合效果看浸透,充分震荡便无忧。


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